在抗体药物开发过程中，筛选出具有特殊功能和表位的抗体往往面临一些挑战。特别是针对一些重要的功能表位，因为免疫系统的免疫优势表位独占因素，全长蛋白中一些重要的功能域表位不能很好的暴露给免疫细胞，或者免疫原性弱，从而不能有效激活免疫反应，导致筛选结果集中于某些区域，忽略了其他重要表位。此外，某些复杂靶点的天然构象也可能因单一片段表达而无法完全呈现，进而影响抗体的准确性和功能。
为了解决这些问题，越来越多的研究开始采用同一靶点的不同蛋白片段（结构域），通过多片段组合策略来更全面地覆盖靶点表位和功能区域。这种方法能够提高筛选的多样性和准确性，加速抗体药物的发现过程，确保筛选出更具药物潜力的抗体。
1、什么是“同一靶点的不同蛋白片段”？
“同一靶点的不同蛋白片段”是指同一个靶点（如受体蛋白、酶或病毒抗原）的多个独立重组蛋白，这些蛋白来自靶点的不同区域或结构域。每个蛋白片段都作为独立的抗原，用于筛选与其结合的抗体。
常见的蛋白片段类型包括：
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ECD片段（Extracellular Domain，胞外结构域）：适用于膜蛋白，如细胞因子受体、免疫检查点等。
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功能域片段：如配体结合区、二聚化界面等功能性区域。
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突变体片段与野生型片段：通过突变引入新表位或优化抗体结合位点。
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近膜端和远膜端结构域：针对不同的抗体药分子形式，治疗性抗体需要结合在不同表位达到最佳效果。例如ADC需要抗体可以诱导强内化效应，很多情况下需要抗体特异性结合近膜端表位。
每个片段都能呈递靶点的不同表位或功能位点，增加了抗体筛选的多样性和准确性。
2、为何抗体筛选需要多个蛋白片段？
如前所述，传统的单一蛋白片段在抗体筛选中有一定局限，尤其是面对复杂靶点时。采用多个不同片段可以覆盖更多表位，提升筛选效率和准确性，成为解决这些问题的有效策略。在抗体筛选过程中用多个蛋白片段的具体优势如下：
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扩大抗体多样性，提高筛选命中率
单一片段蛋白通常只能呈递靶点的一部分表位，这容易导致抗体筛选过程中只聚焦于某些特定的区域。而在复杂的靶点上，不同表位之间可能具有不同的功能作用。因此，单一片段抗原无法全面覆盖靶点的功能性位点。
采用多个蛋白片段组合的策略，可以覆盖靶点的不同表位。这不仅能激活多种B细胞反应，提高筛选抗体的多样性，还能够获得具有不同功能特性的抗体，如阻断抗体、激动抗体和调节型抗体等。
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避免抗体筛选中的构象误差
在抗体筛选中，构象错误或片段偏差可能导致筛选结果不准确。单一片段的蛋白可能无法完全展现靶点的天然结构，尤其是那些具有多结构域的复杂受体。当我们使用多个片段时，可以确保不同片段展示靶点的多样性，从而避免因片段错误折叠而筛选到假阳性抗体。
此外，通过多片段抗原筛选出的抗体，其结合的表位和功能位点更接近靶点的天然状态，因此具有更高的药物化潜力。
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提高筛选效率，缩短开发周期
使用多个蛋白片段可以显著提高筛选效率。传统的抗体筛选通常需要多轮免疫和筛选，每轮都依赖于不同的抗原组合。通过使用多片段抗原，研究人员可以在免疫阶段就通过不同片段的混合免疫覆盖多个表位，避免了反复免疫和筛选的步骤，极大地提高了筛选的效率。
此外，在panning和二筛阶段，使用多个片段抗原还可以确保筛选的抗体针对多个表位，避免抗体对特定片段的依赖。
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开发双表位识别双抗分子
针对一些容易产生免疫逃逸或者突变表位的蛋白靶点，开发双表位双抗有特殊意义，目前也有多个成功案例。例如已经获批上市的针对BCMA靶点的双表位结合CARVYKTI®。
3、蛋白片段在抗体筛选中的应用
蛋白片段在抗体筛选中扮演着关键角色。通过使用多个不同片段，能够全面覆盖靶点表位，提高抗体的多样性、特异性和功能性，优化免疫、筛选及验证阶段的效果，显著加速抗体筛选过程。
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免疫阶段：提高免疫原性
在抗体的免疫阶段，使用多个蛋白片段可以激活多种B细胞反应，提升抗体的免疫原性。当多个片段同时用于免疫时，不同的B细胞亚群会识别不同的抗原区域，从而形成多谱系的抗体反应。这种多样性有助于筛选出对靶点不同功能区域具有反应的抗体，而不是仅仅针对单一区域。
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Display筛选阶段：优化筛选过程
在Phage Display、Yeast Display等抗体筛选技术中，使用多个蛋白片段抗原可以有效提高筛选的特异性和敏感性。通过轮换使用不同片段进行panning，可以提高筛选的准确性，并防止筛选到仅与某个特定片段结合的抗体。
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二筛验证阶段：片段交叉验证
在抗体的二筛和亲和力测定阶段，使用不同片段抗原进行交叉验证是非常关键的。这能够帮助确认抗体是否真正结合靶点的功能性区域，而不是仅仅与标签或非特异性区域结合。多片段抗原的使用能够提供更为准确的表位确认，确保筛选出的抗体具有较高的功能性。
4、多片段蛋白在不同靶点中的应用
多片段蛋白策略在抗体筛选中广泛应用于复杂靶点，如多域受体、GPCR和病毒抗原等。通过覆盖多个功能区域，这种方法能够提高筛选效果，增强抗体的多样性和特异性，适应不同靶点的需求。
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多域受体蛋白（如EGFR、HER2等）
许多受体蛋白，特别是那些涉及信号转导的多结构域蛋白，具有复杂的空间结构和多个功能性表位。通过使用多个蛋白片段，研究人员可以在筛选过程中全面覆盖这些表位，从而发现具有药物潜力的抗体。尤其是在针对HER2、EGFR等靶点时，多片段抗原能够提高抗体对这些关键表位的识别率。
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GPCR和TNFR家族靶点
G蛋白偶联受体（GPCR）和肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族成员是药物开发中的重要靶点，它们的结构复杂，且具有多个结合位点。在这些靶点的抗体筛选中，使用多片段抗原能够有效避免筛选到与非功能性区域结合的抗体，提高筛选结果的可靠性。
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病毒抗原（如 SARS-CoV-2 Spike）
对于病毒抗原，如SARS-CoV-2的Spike蛋白，使用不同的蛋白片段进行筛选可以更全面地覆盖病毒表面不同的结合位点。通过多片段策略，可以提高筛选出中和抗体的概率，尤其是在疫苗和抗病毒治疗研发中，具有重要意义。
5、蛋白片段的制备与质量控制
多片段蛋白的制备不仅需要精准的设计，还要求高效的表达和严格的质量控制。特别是当涉及复杂的靶点时，确保每个片段的正确折叠和功能性至关重要。传统的重组蛋白表达系统（如大肠杆菌、酵母和昆虫）有时难以满足高质量、多片段抗原的生产需求。因此，采用哺乳动物细胞表达系统成为了许多生物制药公司解决这一问题的理想选择。
缔码生物利用哺乳动物细胞表达系统已成功制备了多个热门药物靶点（见下表）的多片段蛋白，确保了蛋白的高效表达和结构的正确折叠。这些蛋白片段不仅在抗体筛选中展现了优异的性能，还能更好地保持靶点的天然构象和功能性，大大提高了抗体筛选的精确度和效率。
