在重组蛋白研究中，His-tag、GST-tag、FLAG-tag、Strep-tag、MBP等蛋白标签已经成为非常常见的工具。它们可以帮助研究人员提高蛋白表达、促进纯化、方便检测，甚至改善部分蛋白的溶解性和稳定性。既然标签如此有益，那为什么还需要无标签蛋白？之所以提到无标签蛋白，并不是说标签蛋白不好。事实上，对于很多蛋白和常规实验而言，标签完全可以保留。但当研究人员越来越关注蛋白的天然结构、活性、分子互作和下游应用可靠性时，去除标签、获得更加接近目标蛋白本身的重组蛋白，就成为一种重要选择。
一、什么是无标签蛋白？
无标签蛋白，也称无标记蛋白或无融合标签蛋白，是指最终获得的重组蛋白中不含额外的亲和标签或融合标签序列。常见的蛋白标签包括：His-tag、GST-tag、MBP、FLAG-tag、Strep-tag和SUMO等。这些标签通常连接在目标蛋白的N端或C端，通过亲和层析等方式帮助目标蛋白表达、检测和纯化。
值得注意的是，无标签蛋白并不等于表达过程中完全不能使用标签。在实际重组蛋白制备中，一个非常常见的策略是：
也就是说，标签可以作为“生产工具”，但最终产品不保留标签。这种策略能够兼顾标签带来的表达和纯化优势，以及最终获得无标签蛋白的需求。文献中也广泛采用通过TEV、3C、Thrombin、Factor Xa、SUMO Protease等蛋白酶去除融合标签的方法。
二、为什么需要无标签蛋白？
蛋白标签最大的优势在于方便。例如，His-tag可以利用固定化金属亲和层析（IMAC）进行纯化；GST、MBP等较大的融合标签还可能帮助某些目标蛋白提高表达量和溶解性。但标签毕竟是人为引入的额外序列。对于一些对结构和功能要求较高的研究，标签可能成为需要考虑的变量。已有研究指出，部分标签可能对目标蛋白的结构、溶解性、生物活性或后续应用产生影响；尤其是较大的融合标签，其潜在影响通常比短肽标签更值得关注。例如，在结构生物学研究中，柔性或无序的标签有时可能影响蛋白结晶；在功能研究中，标签的位置也可能影响蛋白与其他分子的相互作用。所以，与其问：“无标签蛋白是不是一定比带标签蛋白好？”不如问：“我的实验是否需要尽可能接近天然状态的蛋白？”如果答案是肯定的，那么无标签蛋白就值得考虑。
三、表达无标签蛋白，难在哪里？
获得无标签蛋白看似只是把标签去掉，但真正做起来远没有这么简单。
- 去掉标签后，蛋白可能变得“不稳定”
一些融合标签不仅负责纯化，还能够提高目标蛋白的表达量、溶解性甚至折叠效率。因此，蛋白在带标签状态下能够稳定存在，并不意味着去掉标签之后依然保持相同状态。特别是一些容易聚集的蛋白，在酶切去除标签后可能出现沉淀、聚集或回收率下降等问题。已有研究报道，部分蛋白在MBP等增溶标签去除后会发生明显聚集。
- 去标签后，纯化难度增加
带标签蛋白可以直接通过亲和层析进行捕获。而标签被切除后，目标蛋白本身可能不再具有通用的亲和纯化位点，因此通常需要结合：离子交换层析、分子筛/SEC、疏水作用层析或其他特异性纯化策略进一步去除游离标签、蛋白酶、未切割蛋白及其他杂质。因此，无标签蛋白通常需要更加复杂的纯化工艺。
- 切得干净并不只是一个酶切问题
常见的标签去除酶包括：TEV Protease、HRV 3C Protease、Thrombin、Factor Xa、Enterokinase、SUMO Protease等。不同蛋白酶具有不同的识别序列、切割特异性和反应条件，选择哪一种，需要结合目标蛋白本身的序列和性质进行设计。而且，即使选择了高特异性的TEV Protease，也不能简单认为一定不会发生非预期切割。近期研究就发现，某些人源蛋白可能存在非经典TEV切割位点，因此在项目设计阶段进行序列评估仍然十分重要。
四、如何获得无标签蛋白？
方法一：融合标签表达后酶切
这是目前较为成熟和常见的技术路线。首先通过融合标签提高蛋白表达和纯化效率，然后利用特异性蛋白酶切除标签，最后通过二次纯化获得目标蛋白。其中，TEV Protease由于具有较高的序列特异性，被广泛用于重组蛋白标签去除。
方法二：SUMO融合体系
SUMO既可以作为融合标签帮助部分蛋白表达和稳定，也可以利用SUMO Protease进行特异性切割。这种方法尤其适用于部分表达量较低或稳定性较差的蛋白。
方法三：Intein自切割体系
Intein技术可以利用蛋白自身的自切割机制实现标签去除，在特定条件下减少传统外源蛋白酶切割步骤。
方法四：直接无标签表达
对于部分性质较好的蛋白，也可以直接构建无标签表达体系，再结合离子交换、分子筛等非亲和层析方法进行纯化。不过，由于缺少通用亲和标签，直接无标签表达对蛋白本身的表达水平、稳定性和纯化工艺要求更高。
因此，在实际项目中，“带标签表达 + 标签去除”往往是兼顾蛋白产量与最终产品质量的实用方案。
五、哪些研究更适合使用无标签蛋白？
无标签蛋白并不是所有实验的必选项，但在以下场景中尤其值得考虑。
- 结构生物学
X-ray crystallography、NMR等研究通常对蛋白的纯度、均一性、稳定性和结构状态有较高要求。对于部分蛋白，去除柔性标签有助于降低标签对结构研究的潜在影响。
- 蛋白-蛋白相互作用
在蛋白互作研究中，研究人员往往希望观察目标蛋白本身与抗体、受体、配体或其他蛋白之间的相互作用。此时，无标签蛋白可以减少外源标签带来的潜在变量。
- SPR、BLI、ITC等结合实验
对于需要精确分析结合动力学或热力学参数的实验，蛋白的固定方式、空间取向以及结合位点暴露情况都可能影响结果。因此，在特定实验设计中，无标签蛋白可以作为一种更加接近目标蛋白本身的选择。
- 酶活与功能研究
如果研究重点是蛋白本身的酶活、受体功能或配体结合能力，那么使用无标签蛋白可以减少标签可能带来的干扰。当然，具体是否需要去标签，仍然应该根据目标蛋白和实验体系进行判断。
- 抗体发现与药物研发
在抗体开发中，抗原的构象和表位完整性非常重要。如果标签位于潜在结合区域附近，或者标签改变了抗原的空间状态，就可能影响抗体筛选和结合评价。因此，对于部分抗体发现项目，使用无标签抗原能够降低外源标签对实验的潜在影响。
- 复杂膜蛋白研究
对于GPCR、离子通道、转运体等膜蛋白而言，问题往往比“有没有标签”更加复杂。研究人员还需要考虑：蛋白折叠、天然构象、跨膜拓扑、膜环境以及蛋白稳定性。因此，对于复杂膜蛋白，真正有价值的不只是“无标签”，而是尽可能获得接近天然状态、具有正确构象和功能的蛋白。
六、从“无标签”到“接近天然状态”，缔码提供无标签蛋白定制服务
对于不同蛋白而言，无标签蛋白并不存在一种通用的表达和纯化方案。蛋白大小、结构、亚细胞定位、跨膜结构、表达体系以及下游应用，都可能影响最终的工艺选择。因此，无标签蛋白定制的关键，不只是去掉一个Tag，而是从表达构建、标签设计、酶切方案到后续纯化进行整体设计。
缔码生物提供无标签重组蛋白定制服务（Tag-free Recombinant Protein Service），可根据目标蛋白特性和下游应用需求，设计相应的表达、纯化及标签去除方案。从带标签表达和亲和纯化开始，到标签切除、二次纯化及最终无标签蛋白获得，通过整体工艺设计，在保证蛋白产量的同时，尽可能获得接近目标蛋白天然状态的重组蛋白。对于结构研究、功能验证、蛋白互作、抗体发现以及复杂蛋白研究等场景，可根据具体需求选择合适的蛋白形式。
