膜蛋白CAR阳性率检测难题，用PeptiNanodisc一招破解！

1. CAR阳性率检测

在CAR-T细胞治疗日益成熟的今天，如何准确评估CAR在T细胞表面的表达水平，已成为临床前质控、放行标准以及疗效预测的关键环节。其中，“CAR阳性率”（%CAR⁺）作为最直观的指标，通常通过流式细胞术、ELISA等手段检测CAR对其靶抗原的结合能力。

为了准确检测 CAR 在细胞表面的表达情况，研究人员目前常采用以下几种类型的试剂，各有其特点与适用场景。

• Protein L

Protein L是一种常用的通用性检测试剂，能够与抗体的κ轻链结合。它可检测多种不同靶点构建的CAR-T细胞，操作简便，适配性较强。然而，其识别范围有限，仅能识别人源VκⅠ、VκⅢ和VκⅣ亚型以及鼠源VκⅠ亚型，无法识别VκⅡ亚型和大部分鼠源Ig的其他亚型轻链，因此在某些构建背景下存在检测盲区。

• Anti-Fab抗体

lAnti-Fab抗体能够识别抗体Fab区域，具备一定的通用性，也常用于检测不同靶点的CAR构建。然而，这类试剂通常来源于多克隆抗体，导致背景值较高、批间差异性大，且商品化产品质量参差不齐，影响数据的重复性和准确性。

• Anti-idiotype抗体

Anti-idiotype抗体是一种高度特异性的工具，可直接识别scFv结构中的抗原结合位点。这类抗体具备高特异性、高灵敏度、低背景等优点，是CAR特异性检测的理想选择。但受限于其高度专属性，市售产品稀缺，往往需要定制开发，周期较长（一般为6个月左右），不适用于快速筛查或标准质控流程。

• 靶点蛋白

l靶点蛋白作为检测工具也是常用策略之一。该方法依赖CAR结构中scFv与目标抗原的结合特性，因而具备良好的靶点专属性，可在一定程度上评估CAR与靶标的功能性结合能力。但其检测灵敏度会受到scFv与靶蛋白之间亲和力的显著影响，若亲和力较弱，可能导致信号不强或假阴性。此外，靶点蛋白的纯度、构象是否正确等因素也直接影响检测结果。

然而，检测的准确性高度依赖于所用抗原蛋白的结构完整性与构象保真度。目前常用的靶抗原检测材料主要包括：

• 可溶蛋白片段：如胞外区Fc融合蛋白，结构不完整、构象不稳定；

• 细胞系或细胞膜表达系统：批次差异大、背景信号高、操作复杂；

• MSP纳米盘重构膜蛋白：需共组装脂质，构建步骤繁琐，受脂组影响较大。

在此背景下，如何以简便、稳定的方式展示天然构象的跨膜蛋白，成为CAR阳性率检测的突破点。为实现更真实、稳定且高通量的CAR阳性率评估，亟需一种能够精准重现靶抗原天然构象、简化操作流程、降低检测背景的新型工具。PeptiNanodisc平台应运而生，以其独特的短肽自组装机制，为跨膜蛋白在CAR检测中的展示提供了全新解决方案。

2. PeptiNanodisc&CAR阳性率检测

PeptiNanodisc 是一种基于短肽自组装的膜蛋白重构平台，由两段人工设计的 amphipathic α-肽包裹目标膜蛋白形成纳米盘，无需添加脂质或膜支撑蛋白。该技术可稳定重构多类膜蛋白，尤其适合呈现天然构象的跨膜靶点，用于 CAR-T 细胞检测等功能研究。

2.1 什么是PeptiNanodisc？

PeptiNanodisc，是利用特殊肽段包裹住膜蛋白的疏水部分（类似于肽盘），从而保护其不受水溶液的影响。由于不存在磷脂和去垢剂，利用PeptiNanodisc平台表达出的膜蛋白可以用于细胞实验。而且，理论上肽盘可以像‘通用支架’一样，适用于各种膜蛋白，不受蛋白大小限制。该技术可稳定重构多类膜蛋白，尤其适合呈现天然构象的跨膜靶点，用于 CAR-T 细胞检测等功能研究。

Fig 1. Assembly of PeptiNanodisc.

2.2 PeptiNanodisc优势

在CAR-T检测体系中，一个优秀的靶抗原材料必须满足三大核心标准：结构真实、检测稳定、适配性强。PeptiNanodisc 正是在这三方面同时实现突破，为CAR阳性率检测带来了多个关键优势：

2.2.1 真实构象还原 —— 展示完整的跨膜结构

PeptiNanodisc无需额外脂质或膜支撑蛋白，即可将靶抗原重构成稳定的类原生构象状态。对于结构复杂的膜蛋白，PeptiNanodisc 能保留其跨膜区、结构域之间的空间关系，最大程度还原其在细胞膜上的三维状态。这意味着CAR分子识别的不再是“蛋白碎片”，而是完整靶标，就像它在肿瘤细胞表面那样。这种原始构象的展示，大幅提升了CAR与其目标结合的亲和力与特异性，从而提高检测阳性率，降低假阴性风险。

2.2.2 高稳定性与重复性 —— 提升信号一致性、降低背景干扰

传统的融合蛋白在体外环境中极易发生聚集、变性，导致实验间重复性差。而PeptiNanodisc重构后的抗原具有良好的热稳定性和结构一致性，在多种检测条件下（如37°C孵育、4°C储存、冻融）都表现出出色的抗性。

此外，PeptiNanodisc 中无脂质背景，无Fc区、无非特异性标签，不易引发抗体的背景结合，有效提升流式和ELISA等免疫检测平台的信噪比，让结果更清晰、判读更可靠。

2.2.3 高通量兼容性 —— 适配多种检测平台与标签系统

PeptiNanodisc 构建灵活，支持多种标签（如Strep、FLAG）以及多样化功能修饰（如荧光标记、biotin标记等），可广泛应用于以下检测方式：

• 流式细胞术：将抗原偶联荧光标记，用于识别CAR阳性细胞；
• ELISA功能验证：板面包被抗原，检测CAR抗体/结构体的结合活性；

此外，其标准化纯化流程及良好的可溶性，适合大批量生产及自动化检测平台的对接，利于质控流程标准化。

2.2.4 更高批次一致性与合成效率 —— 为商业化检测提供保障

PeptiNanodisc 核心成分为人工合成的短肽，来源清晰、结构稳定，不依赖细胞表达或天然蛋白提取，极大降低批间差异与制备难度。这种“合成可控”的构建方式，特别适合：

• 高标准CAR-T生产环节中的放行检测；
• 多中心临床样本中统一方法验证；
• 新CAR靶点研发早期的功能筛选与结构优化。

PeptiNanodisc真正解决了“怎么让CAR识别到正确的抗原”这一核心难题。它让CAR-T检测从“看得见”走向“看得准”，为CAR产品质控与结构优化提供了更真实、更稳定、更可靠的技术支撑。

3. 缔码PeptiNanodisc案例展示

• CAR阳性率检测

① 未标记PeptiNanodisc检测CAR阳性率

采用流式细胞术，分别用GPRC5D PeptiNanodisc (FLP400011)和G4S-PE蛋白来检测GPRC5D CAR细胞阳性率。

结果表明：GPRC5D PeptiNanodisc (FLP400011)检测GPRC5D CAR阳性率与G4S-PE检测方法效果相当。

② 荧光标记PeptiNanodisc检测CAR阳性率

采用流式细胞术，分别用FITC标记CLDN18.2 peptiNanodisc和G4S-PE蛋白来检测CLDN18.2 CAR细胞阳性率。

结果显示：FITC标记CLDN18.2 peptiNanodisc检测CLDN18.2 CAR阳性率与G4S-PE方法检测结果相当，且无需荧光二抗，操作更方便。

• SDS-PAGE&ELISA验证

经SDS-PAGE 和ELISA验证，peptiNanodisc蛋白表现出高纯度及良好的抗体结合活性。

• 冻干及保存稳定性检测

采用ELISA和SDS-PAGE检测不同条件下的PeptiNanodisc，结果显示其具有良好稳定性及结合活性。

ELISA分别检测液体状态和冻干粉状态下GPRC5D PeptiNanodisc与GPRC5D抗体结合活性（左）；ELISA检测GPRC5D PeptiNanodisc分别在-20℃、37℃ 24h、37℃ 48h、37℃ 72h条件下，其与GPRC5D抗体结合活性（中）；SDS-PAGE分析不同条件下：-80℃液体状态、-20℃冻干粉状态及冻干粉状态37℃分别放置24h、48h、72h的GPRC5D PeptiNanodisc（右）

• 缔码PeptiNanodisc部分产品列表